Кластеризованные технологии редактирования генов с регулярным чередованием коротких палиндромных повторов или CRISPR — генов предоставляют ученым огромный уровень гибкости, когда дело доходит до точных манипуляций с геномом и диагностики, а это означает, что способов, которыми они могут изменять ДНК и включать или выключать гены, больше, чем когда-либо прежде. Ряд разработок в области редактирования генов CRISPR проложили путь для этого прогресса.
Здесь мы рассмотрим, почему CRISPR / Cas9 идеально подходит для инактивации генов и почему базовое редактирование и первичное редактирование лучше подходят для лечения генетических нарушений, чем разрушительные подходы. Мы также коснемся важности диагностики на основе нуклеиновых кислот и систем CRISPR / Cas, включая Cas13.
Те, кто интересуется диагностикой CRISPR, могут найти дополнительную информацию по этим темам в журнале life sciences BioTechniques.
CRISPR / Cas9
Из множества технологий CRISPR, доступных ученым, часто используется технология CRISPR / Cas9. Хотя нацеливание фермента Cas9 на геномную последовательность является относительно точным процессом, восстановление клеткой полученного двухцепочечного среза не является точным. Таким образом, технология CRISPR/ Cas9 лучше подходит для инактивации генов, чем для репарации. Это связано с тем, что метод, известный как негомологичное соединение концов, опосредует репарацию CRISPR / Cas9, которая может быть искажена мелкими вставками или делециями.
Коррекция генов: базовое редактирование и первичное редактирование
Коррекция генов обычно является более эффективным подходом, чем разрушение, когда дело доходит до лечения генетических заболеваний. Дэвид Лю, один из химико-биологов Гарвардского университета, совместно со своей командой разработал концепцию двух подходов к коррекции генов: основного редактирования и базового редактирования. Эти подходы к редактированию усиливают точное нацеливание CRISPR, ограничивают способность Cas9 разрезать ДНК в выбранном участке и вырезать единственную цепочку ДНК, что безопаснее и менее разрушительно для клеток, чем альтернативные подходы.
Базовое редактирование объединяет каталитически ослабленную форму Cas9 с ферментом, который стимулирует химическое превращение одного нуклеотида в другой. Например, фермент может преобразовывать цитозин в тимин или аденин в гуанин. С 2016 года, когда впервые было описано редактирование оснований, этот тип редактирования быстро перешел к клиническому применению. Компания Luu Beam Therapeutics получила одобрение Управления по контролю за продуктами питания и лекарствами США на экспериментальное применение метода редактирования у пациентов с серповидно-клеточной анемией. Тем не менее, этот вид редактирования делает доступными только некоторые базовые изменения.
Между тем, prime editing — это новая разработка в области редактирования генов CRISPR. Этот подход к редактированию связывает Cas9 с типом фермента, называемого обратной транскриптазой, и включает желаемое редактирование геномной последовательности с использованием модифицированной направляющей РНК. В ходе многоступенчатого биохимического процесса эти компоненты копируют направляющую РНК в ДНК, которая заменяет целевую последовательность генома.
Хотя первичное редактирование не получило такого развития, как базовое, появляются новые итерации этого процесса. Например, Хен Бам Генри Ким, один из специалистов по редактированию генома Медицинского колледжа университета Йонсей, работал со своей командой, чтобы доказать, что они могут достичь эффективности до 16% при внедрении этого вида редактирования генов для коррекции мутаций в генах сетчатки у мышей.
Кроме того, Лю и его команда обнаружили, что они могут использовать оборудование prime для содействия встраиванию последовательностей ДНК размером с ген в геном. С помощью этого оборудования они могут предложить более безопасную и лучше контролируемую генную терапию. Хотя этот процесс не является полностью эффективным, даже небольшое исправление может иметь большое значение.
Важность диагностики на основе нуклеиновых кислот
Быстрые и точные диагнозы и рекомендации по лечению необходимы для достижения оптимальных результатов у пациентов. Биомаркеры на основе нуклеиновых кислот, ассоциированные с заболеванием, могут иметь решающее значение для диагностики. Это связано с тем, что ученые могут амплифицировать РНК и ДНК из следовых количеств, что облегчает их высокоспецифичное обнаружение за счет спаривания комплементарных нуклеотидов.
В результате диагностика на основе нуклеиновых кислот подняла планку для диагностики ряда хронических и острых состояний, особенно состояний, вызываемых инфекционными заболеваниями. Точное и быстрое тестирование на основе нуклеиновых кислот особенно важно во время вспышек инфекционных заболеваний, таких как Covid-19, для эффективного контроля распространения заболевания.
Диагностика на основе нуклеиновых кислот, основанная на количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) или секвенировании, в настоящее время особенно распространена, особенно в клинических лабораториях. Универсальность, надежность и чувствительность ПЦР сделали эту технологию идеальной для обнаружения биомаркеров ДНК и РНК. Диагностика, основанная на обнаружении нуклеиновых кислот, часто является наиболее чувствительной и специфичной. Однако для большинства анализов требуется дорогостоящее оборудование и обученный персонал.
При изотермической амплификации нуклеиновых кислот нет необходимости в термоциклерах. Однако неспецифическая амплификация может привести к снижению специфичности обнаружения. Ученые могут выполнять дополнительные считывания, используя флуоресцентные зонды, молекулярные маяки или зонды со смещением олигоцепей для повышения специфичности.
Но ученым часто нужны технологии, сочетающие экономичность и простоту использования изотермической амплификации с диагностической точностью ПЦР. В идеале диагностика также должна обладать специфичностью к одному нуклеотиду, что имеет решающее значение для идентификации мутаций, придающих устойчивость к противовирусным препаратам и антибиотикам. Диагностика на основе CRISPR потенциально может соответствовать этим критериям.
Важность систем CRISPR / Cas
Среди бактерий и архей существует несколько систем CRISPR / Cas, которые могут использовать ученые. Все эти системы зависят от РНК CRISPR (crRNA), которая позволяет Cas-белкам распознавать и расщеплять нуклеиновые кислоты-мишени. Ученые могут запрограммировать crRNA на интересующую область РНК или ДНК путем гибридизации с комплементарной последовательностью. В некоторых системах эта последовательность может быть ограничена близостью к последовательности, фланкирующей протоспейсер, или к мотиву, примыкающему к протоспейсер (PAM).
До сих пор ученые использовали CRISPR / Cas в различных приложениях, включая
Обнаружение нуклеиновых кислот.
Биоимиджинг нуклеиновых кислот.
Целенаправленное редактирование геномов, транскриптомов и эпигеномов.
Запись клеточных событий.
Диагностика на основе CRISPR развивается быстрыми темпами благодаря специфичности технологий CRISPR, простоте использования и программируемости. В результате ученые все ближе подходят к созданию диагностических тестов на основе нуклеиновых кислот, которые могут стать стандартом клинической помощи.
С момента начала редактирования генов CRISPR количество доступных систем CRISPR / Cas быстро росло. Сегодня существует два класса, шесть типов и еще несколько подтипов этих систем. Ученые классифицируют эти классы, типы и подтипы по природе эффекторного комплекса рибонуклеопротеина.
В то время как системы класса 1 характеризуются множеством эффекторных белков, системы класса 2 включают crRNA-связывающий белок. Поскольку эти системы легче реконструировать, они чаще используются в диагностике. Системы класса 2 включают ферменты с сопутствующей активностью, которые являются основой различных диагностических анализов на основе CRISPR. Тем не менее, ученые разработали некоторые системы класса 1 с диагностикой, либо с использованием собственного комплекса третьего типа, либо компонентов системы класса 2.
CRISPR / Cas13
Роль системы CRISPR / Cas как бактериальной иммунной системы против вирусных инфекций наделяет ее способностью к точному расщеплению специфических последовательностей нуклеиновых кислот. Многие первые приверженцы редактирования генов CRISPR рассматривали применимость системы для диагностики вирусов из-за этой способности. Тем не менее, каждый фермент Cas индивидуален и имеет разное применение. Например, хотя Cas9 является лучшим ферментом для манипуляций с геномом на основе CRISPR, в нескольких диагностических подходах на основе CRISPR используется Cas13, семейство молекул, нацеленных на РНК, которые молекулярный биолог Фэн Чжан идентифицировал со своей командой в 2016 году.
Cas13 использует свой справочник по РНК для идентификации РНК-мишени путем спаривания оснований, а затем активирует рибонуклеазную активность. Ученые могут использовать эту рибонуклеазную активность в качестве диагностического инструмента с помощью репортерной РНК. Помимо разрезания РНК, на которую нацелена направляющая РНК, Cas13 также выполняет “побочное расщепление” любых близлежащих молекул РНК.
В некоторых диагностиках на основе Cas13 используется репортерная РНК, которая привязывает флуоресцентную метку к молекуле-гасителю, препятствующей флуоресценции. Cas13 активируется, когда распознает вирусную РНК. Затем Cas13 отключает репортер и высвобождает флуоресцентную метку из гасителя, генерируя обнаруживаемый сигнал.
Некоторые вирусы оставляют настолько сильную сигнатуру, что ученые могут добиться обнаружения без амплификации, упрощая диагностику на месте оказания медицинской помощи. В качестве примера, в Институте вирусологии Гладстона, Сан-Франциско, Дженнифер Дудна и Мелани Отт продемонстрировали быстрый тест CRISPR / Cas13 на SARS-CoV-2 без амплификации с помощью мазка из носа с использованием камеры смартфона.
Процессы амплификации РНК могут повысить чувствительность к следовым вирусным последовательностям. Например, Пардис Сабет, генетик Массачусетского технологического института и Гарвардского университета, работала со своей командой над разработкой микрофлюидной системы, которая выявляет патогенные микроорганизмы, используя амплифицированный генетический материал из нескольких микролитров образца. Исследовательская группа разработала инструменты обнаружения на основе CRISPR, которые могут идентифицировать более 169 вирусов человека одновременно.
Ученые также могут максимально эффективно использовать другие ферменты Cas, такие как Cas12, который обладает свойствами, аналогичными Cas13, но нацелен на ДНК, а не на РНК. Используя ряд белков Cas, ученые могут идентифицировать более широкий спектр патогенов и эффективно диагностировать заболевания.